Sekundäre Aktive Transporter

< zurück zu den Projekten

Sekundäre aktive Transporter bilden die größte und vielfältigste Gruppe von Membranproteinen, die Substrate durch die Membran transportieren (http://www.tcdb.org/). Sekundäre aktive Transporter koppeln den Abwärtsfluss eines Ions (normalerweise ein Natriumion oder ein Proton) entsprechend der Differenz seines elektrochemischen Potentials mit dem Aufwärtstransport eines Substrats. Die Substrate können nahezu alles sein: ein anderes Ion, ein Zucker, ein Vitamin, eine Aminosäure oder ein exportiertes Protein. Somit sind diese Transporter an der Nährstoffaufnahme, der Aufrechterhaltung von Ionengradienten und -spannungen, dem Export von Toxinen, Antibiotika und Proteinen beteiligt.

NhaA, ein typischer sekundärer aktiver Transporter. Der Na+ / H+ -Antiporter NhaA aus E. coli ist der am besten charakterisierte Na+ / H+ -Antiporter. Die Rolle von Na+ / H+ -Antiportern ist die Extrusion von Na+ und Li+, die Homöostase des zytoplasmatischen pH-Werts und in höheren Organismen zur Kontrolle des Zellvolumens. Wir konnten die Struktur einer herunterregulierten Form bei pH 4 bestimmen (Hunte et al., (2005) Nature. 435, 1197-1202).

NhaA, ein typischer sekundärer aktiver Transporter. Der Na+ / H+ -Antiporter NhaA aus E. coli ist der am besten charakterisierte Na+ / H+ -Antiporter. Die Rolle von Na+ / H+ -Antiportern ist die Extrusion von Na+ und Li+, die Homöostase des zytoplasmatischen pH-Werts und in höheren Organismen zur Kontrolle des Zellvolumens. Wir konnten die Struktur einer herunterregulierten Form bei pH 4 bestimmen (Hunte et al., (2005) Nature. 435, 1197-1202).

In der Vergangenheit haben wir einen fokussierten Ansatz verwendet, um die Struktur ausgewählter sekundärer aktiver Transporter zu kristallisieren und zu bestimmen. In Zusammenarbeit mit Prof. Etana Padan (Hebräische Universität, Jerusalem, Israel) erhielten wir Kristalle von angemessener Qualität des Natriumionen / Protonen-Antiporters NhaA von Escherichia coli und konnten dessen Struktur bestimmen. Die Aktivität von NhaA wird streng durch den pH-Wert gesteuert, und unsere Struktur ist die einer herunterregulierten Form mit niedrigem pH-Wert. Wir versuchen, den Aktivierungsmechanismus sowohl durch rechnerische als auch durch experimentelle Methoden zu verstehen. Versuche, Kristalle der aktiven Formen mit hohem pH-Wert zu erhalten, sind im Gange.

In einem genomik-basierten Ansatz beginnen wir mit den Genen sekundärer aktiver Transporter von Aquifex aeolicus und versuchen, sie in Escherichia coli zu exprimieren. Parallel dazu haben wir homologe Gene aus dem hyperthermophilen Archäon Pyrococcus furiosus und dem pathogenen E. coli-Verwandten Salmonella typhimurium (http://www.membranetransport.org/) ausgewählt. Wir wollen wissen, welcher dieser Organismen die beste Quelle für Gene in Bezug auf Expression sowie Stabilität und Kristallisationserfolg mit den Transportern ist. Die Gene werden parallel unter Kontrolle relativ milder Promotoren in mehrere Expressionsplasmide kloniert und auf Expression getestet. Membranen werden durch Zugabe von Detergenzien gereinigt und solubilisiert, gereinigt und für Kristallisationsversuche verwendet.

Schematische Darstellung der Schritte auf dem Weg zur 3D-Struktur und der damit verbundenen Abnutzung. Die Eigenschaften der Zielproteine führen im nächsten Schritt zu einer reduzierten Anzahl von Zielen.

Schematische Darstellung der Schritte auf dem Weg zur 3D-Struktur und der damit verbundenen Abnutzung. Die Eigenschaften der Zielproteine führen im nächsten Schritt zu einer reduzierten Anzahl von Zielen.

Die wichtigste Voraussetzung für die Kristallisation ist die Verfügbarkeit einer stabilen und homogenen Proteinzubereitung. Sobald die Stabilität und Homogenität ausreichend sind, beginnen wir mit Kristallisationsversuchen. Zum Aufstellen der Kristallisationsplatten stehen Roboter zur Verfügung, und zur Inkubation steht eine Ferninspektion zur Verfügung (siehe ANLEITUNG). Häufig werden Kristalle beobachtet, die jedoch selten zu einer hohen Auflösung gebeugt werden, wie dies für die Strukturbestimmung erforderlich ist. Zur Verbesserung der Qualität der Kristalle müssen Waschmittel, Fällungsmittel, pH-Wert, Lipidgehalt, Additive, Salze und Temperatur optimiert werden. Die Wahl des Waschmittels oder der Waschmittelmischung und das Vorhandensein der richtigen Lipide ist am wichtigsten.

Bei der Arbeit mit Zielproteinen ohne funktionelle Charakterisierung ist es notwendig, deren Funktion zu identifizieren. Zu diesem Zweck werden ausgewählte Transportproteine durch funktionelle Komplementation in E. coli oder Transporttests oder durch Verwendung einer elektrophysiologie auf der Basis einer festen Membran analysiert.